Minimate™ 캡슐로 교반 셀 시스템을 대체하여 생산성 향상

소개

Ultrafiltration은 생물학적 활동 및 시간 보존

단백질 정제 기술은 시료 농축 시의 화학적 침전 또는 완충액 교환 시의 투석과 같은 다양한 방법에서부터 ultrafiltration 멤브레인을 사용하는 압력 중심 정제 횡류 시스템으로 발전해 왔습니다. UF(ultrafiltration) 기법은 공극 크기가 확실히 정의된 중합체 멤브레인을 사용하여 크기에 따라 분자를 분리하는 방법을 사용합니다. 간단히 말하면 UF 절차는 유압을 사용하여 작은 분자는 UF 멤브레인을 통과하게 하고 큰 분자는 남겨두는 방식입니다.

화학적 침전도 단백질 시료 농축 시 사용할 수 있으나 ultrafiltration 여과의 다른 점은 화학적 상호작용이 아닌 기계적 방식을 사용하므로 변성 용매나 염을 추가하지 않고 단백질 시료를 농축할 수 있다는 점입니다. 투석 기술을 사용하는 완충액 교환은 완충액을 대량 사용하며 이 용액에 작용하는 유일한 힘은 확산 작용이므로 작업 과정에 며칠이 걸릴 수 있습니다. 사용이 간편하고 사전 조립된 ultrafiltration 장치는 기타 여러 기법에서 요구되는 장기간 처리 과정 없이도 농축이나 완충액 교환 절차를 신속하게 수행할 수 있습니다.

횡류를 사용한 Ultrafiltration 최적화

Ultrafiltration는 DFF(Direct Flow Filtration) 또는 TFF(Tangential Flow Filtration, 그림 1)와 같은 두 가지 작동 모드로 수행할 수 있습니다. DFF은 원심 분리기를 사용하는 소량(최대 30mL)에 적합하나 DFF 기술은 멤브레인 파울링(1)이라는 문제를 유발할 수 있습니다. 겔 레이어 형성을 줄이려면 유동 혼합 막대 구성(회분식 셀)을 사용하여 멤브레인의 업스트림 측에 횡류를 생성하거나 통제된 청정 공기 흐름을 생성하는 방식을 사용할 수 있습니다. 회분식 셀 작동 방식은 UF 성능을 다소 개선할 가능성은 있으나 여전히 한계가 있습니다.
 







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교반 속도 및 후속 수준이 해당 범위의 반경에 따라 달라지는 막대의 범위에 영향을 받기 때문에 최적의 성능을 얻을 수 있습니다.

표 1

DFF와 TFF의 그래프 비교

(A) 시료 용액이 피드 채널을 통해 흐르며 멤브레인 표면을 따라(접해) 흐를 뿐 아니라 멤브레인을 통과하기도 합니다. 횡류는 분자가 표면에 쌓이지 않도록 하여 파울링을 방지합니다.
(B) TFF 과정은 direct flow filtration에서 나타나는 유량 속도의 급격한 저하를 막아주므로 멤브레인 표면의 단위 면적당 더 많은 양을 처리할 수 있습니다.


(A) 피드가 멤브레인으로 직접 전달됩니다. 공극보다 큰 분자가 멤브레인 표면에 쌓여 겔을 형성하면 표면이 막히고 결국 액체의 멤브레인 통과가 방해를 받습니다.
(B) 여과량이 증가하면 파울링도 늘어나 유량 속도가 급격히 낮아집니다.

Minimate 캡슐을 사용하여 최적화된 횡류 성능

회분식 셀 기술과 비교하여 TFF 처리는 재현 가능하며 통제가 쉽고 모니터링이 가능합니다(4). 전반적으로 TFF 작동을 통해 멤브레인 표면 전체에 시료가 고르게 천천히 반복 회전하므로 멤브레인 파울링이 효과적으로 제어됩니다. 멤브레인 표면 전체를 활용하므로 유량 속도가 높아져 처리 시간이 대폭 줄어들고 생산성이 증가합니다. Minimate 캡슐은 사전 조립되고 사용이 간편하며 사용자의 별도 조치 없이도 액체 1리터를 처리할 수 있습니다. 반면 대부분의 회분식 셀 장치의 처리 용량은 350mL 이하이며 반복해서 열어 주어야 하므로 완전성이 보장되지 않으며 기술자의 귀중한 시간이 소요됩니다. 단일 농축 프로토콜 수행 시 또는 보다 복잡한 효소 정제 과정에서 회분식 셀 장치에 비해 Minimate 캡슐을 사용할 경우 시간이 대폭 절감된다는 사실을 입증했습니다.

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재질 및 방법

Minimate TFF 캡슐

Minimate TFF 캡슐에는 일체형 장치에 완전히 봉합된 Omega™ ultrafiltration 멤브레인(폴리에테르술폰)이 들어있습니다. 일체형 장치는 다양한 분자량 절단체로 제공됩니다. Minimate 캡슐을 사용할 경우 최대 1리터인 시료 배치 크기는 사용자가 거의 개입하지 않으면서 최소 5mL까지 농축할 수 있습니다. 재활용/일회용 캡슐은 폐쇄된 루프 연결 방식으로 동일 장치를 사용하여 단일 또는 연속 농축/diafiltration 단계를 수행할 수 있습니다. TFF 처리에는 다양한 연동 펌프를 사용할 수 있습니다.

Minimate 캡슐 설치
접선 유동 여과: Minimate 캡슐 설치

회분식 셀 장치

시판되는 표준 회분식 셀 장치는 제조업체 지침에 따라 조립, 작동 및 세척했습니다. 작동 면에서 TFF와 가장 큰 차이 중 하나는 원하는 압력을 얻으려면 압력 용기나 질소 탱크가 필요하다는 점이었습니다. 또한 회분식 셀 장치에서는 diafiltration이 필요한 경우 연구자가 별도로 장치를 조립, 개봉, 충전, 분해해야 했습니다.

기술 데이터 Minimate 회분식 셀
유효 여과 범위 50cm2(0.05ft2) 28.7cm2(0.03ft2)
권장 횡류 유량 40mL/min - 50mL/min 해당 없음
작동 온도 범위 5°C - 50°C(41°F - 122°F) 5°C - 50°C(41°F - 122°F)
최대 작동 압력 4바(60psi) 400kPa 55psi(N2 또는 여과된 공기)
시스템 가동량(피드/잔류물) 5mL - 10mL 5mL - 10mL

다이어그램 1

Minimate TFF 캡슐 시스템(펌프, 압력계, 잔류물 나사 클램프, 저수조 및 튜브 연결 포함)
Minimate TFF 캡슐 시스템(펌프, 압력계, 잔류물 나사 클램프, 저수조 및 튜브 연결 포함)

Minimate 캡슐을 사용하여 간단히 가동

사용이 간편한 Minimate 캡슐을 연동 펌프 시스템에 연결하여 잔류물 채널에 횡류를 만들 수 있습니다. Minimate 장치의 작동 및 미세 조정에 대한 자세하고 완전한 프로토콜은 취급 및 사용 설명서 및 제시된 기타 문서(2, 3, 및 5)에서 찾아볼 수 있습니다. 간단한 작동 개요가 다음과 같이 제시되어 있습니다.

설치
  1. 필요한 모든 튜브를 캡슐에 연결합니다. 시스템 가동량을 줄이기 위해 튜브의 길이는 최대한 짧게 합니다. 캡슐의 피드 포트에 압력계를 설치합니다.
  2. 필요한 유량을 낼 수 있도록 연동 펌프를 보정합니다.
  3. 캡슐의 잔류물 쪽을 약간 올려 공기를 빼냅니다.
  4. 나사 클램프를 잔류물 튜브에 살짝 부착합니다.

처리
  1. 여과할 용액을 피드 저수조에 넣고 잔류물 선과 여과 선 양쪽으로 보내 별도의 용기에 흘러들게 합니다. 용액을 분당 40mL의 유량으로 캡슐을 통과시킵니다.
  2. 대략 시스템 정체 용량(10mL) 정도의 액체가 잔류물 및 여과 선을 통과해 들어간 다음 잔류물 선을 피드 저수조에 다시 연결하고 여과선은 분리된 용기에 배치합니다.
  3. 원하는 농도에 이를 때까지 이 과정을 계속합니다. 만약 용액 500mL를 5배 농축하는 경우 피드 저수조에 100mL가 남아있을 때 여과를 중단합니다.
  4. 시료 저수조(2)에 새 완충액을 추가하여 diafiltration(선택 사항)을 실시합니다.
  5. 남은 양이 10mL 미만인 경우 15mL 시린지를 사용하여 잔류물을 포집하고 최종 농축 펌프 속도를 낮춰 거품이 생기지 않도록 합니다.

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결과 및 논의

Minimate 장치를 통한 생산성 증가

처리 시간은 전반적인 장치 성능을 나타내는 지표입니다. 10K Minimate 캡슐 5개를 작동시킨 결과를 유사한 회분식 셀 구성(고유량 PES 또는 재생 셀룰로오스 멤브레인 사용)을 사용한 비슷한 처리 조건과 직접 비교해 보았습니다. 2mg/mL BSA 1리터를 10배로 농축하는(100mL로) 실험을 실시하여 두 구성 간의 처리 시간 차이를 알아보았습니다. 이 작동 조건에서 Minimate 캡슐을 사용한 전체 처리 과정은 단 1시간 만에 완료되었습니다(그림 2). 반면 회분식 셀 장치의 처리 시간은 멤브레인 구성과 관계 없이 5배 더 걸렸습니다. 긴 처리 시간 외에도 회분식 셀 장치는 보충 주기가 반복되기 때문에 사용자의 개입이 필요했습니다.

표 2

Minimate 캡슐 사용 시 처리 시간 대폭 단축
접선 유동 여과: Minimate 캡슐 사용 시 처리 시간 대폭 단축  

350mL 회분식 셀 장치 또는 Minimate 캡슐에서 2 mg/mL BSA 용액을 10배(1000mL에서 100mL로) 농축했습니다. Minimate에는 사전 어셈블링된 Omega 10K 멤브레인이 들어 있습니다. 50mL/min로 설정된 횡류를 잔류물 루프 배압과 함께 적용하여 초기 여과 유량이 약 15mL/min가 되도록 했습니다. 회분식 셀 장치는 PES(폴리에테르술폰)나 RC(재생 셀룰로오스) 디스크를 사용했고 55psi의 여과된 공기로 압력을 가해 약 6mL/min의 여과 유량으로 시작했습니다. 오차 바는 5개의 독립 실행에 대한 표준 오차를 보여줍니다.

여과 및 잔류물 분획 모두 260nm의 흡수력이 측정되어 단백질 농축 과정이 확인되었습니다. 회분식 셀 장치를 사용한 경우 처리 과정 중 BSA가 10K PES 멤브레인에서 누출되어 무결성 결함이 드러났습니다. 이어서 두 구성 간의 통계적으로 유의한 비교를 보장하기 위해 총 5회의 성공적인 회분식 셀 실행이 완료될 때까지 추가 실험을 실시했습니다.

취급 및 장치의 완전성

처리 과정의 완전성 결함은 시간 손실뿐 아니라 귀중한 시료가 파괴되는 결과도 가져올 수 있습니다. Minimate 장치는 봉합된 일체형 캡슐로 제조되므로 최종 사용자의 조립이 필요 없습니다. TFF를 사용하는 경우 1리터의 단백질 시료를 단번에 처리할 수 있기 때문에 시료 손상 위험이 줄어듭니다. 반면 SC(회분식 셀) 장치는 복잡한 조립으로 UF 멤브레인 디스크를 장치 기판에 놓고 나사로 죄어야 하기 때문에 이 과정에서 누출이나 우회의 위험이 생길 수 있습니다. 누출이 심한 경우 여과 유량이 비정상적으로 높아지기 때문에 쉽게 찾아낼 수 있습니다. 그러나 정말 심각한 문제는 부분적인 우회로, 정상적인 작동으로 보이기 때문에 너무 늦어 손을 쓸 수 없거나 과정이 종료될 때까지 단백질 손실이 발견되지 않습니다.

단백질 우회 여부를 확인하기 위해 여과 과정을 모니터링하는 가운데, 회분식 셀 작동에 사용된 비교 대상 PES 멤브레인에 심각한 안전성 결함이 발생한 사실이 관찰되었습니다(그림 3). Minimate TFF 및 재생 셀룰로오스 회분식 셀 장치는 모두 완전성에 문제가 없었지만 비교 대상 PES 멤브레인은 10회 실행 중 5회에 걸쳐 처리 과정 중 각각 다른 단계에서 문제가 발행했습니다.

표 3

사전 어셈블링된 Minimate을 통한 완전성 결함 위험 제거
일체형 Minimate TFF 및 재생 셀룰로오스 회분식 셀 장치 

시료 농축 과정을 그림 2의 설명과 같이 수행했습니다. 시작 물질, 최종 잔류물, 최종 여과 풀의 부분 시료를 분석하여 280nm의 단백질 농도를 얻었습니다. 평균 농도는 오차 바가 (5 - Minimate), (10 - SC PES) 및 (5 - SC RC) 실행에 대해 각각 표준 오차를 표시하도록 구성됩니다. 그래프를 간단히 표시하기 위해 Y2 축의 잔류물 값에 여과 과정에서 발생한 10배 농축이 포함되도록 구성됩니다.

Cyclooxygenase-2(COX-2) 정제

Cayman Chemical(미시건 주 앤아버(Ann Arbor, MI))은 조직 균질액에서 양의 COX-2 효소 정제 시 Minimate 캡슐 사용이 회분식 셀 구성보다 낫다는 것을 확인하기 위한 비교 연구를 수행했습니다(표 1). 이들은 효소 생산 과정에서 회분식 셀 장치를 대체한 새로운 프로토콜을 쉽게 개발할 수 있었습니다. TFF 절차에서 파생된 COX-2 특정 활동이 그들이 사용하고 있던 회분식 셀 장치에서 파생된 활동과 일치한다는 것을 알게 되었습니다. 그러나 가장 중요한 것은 TFF의 경우 처리 시간이 거의 1/3로 단축되어 결과적으로 1회 할당 시간에 두 번째 과정을 수행할 수 있다는 점이었습니다.

Pall Ultrasette™ 및 Minimate 장치를 모두 사용하는 Cayman COX-2 프로토콜:
  1. 완충액에서 양의 태반엽을 균질화합니다.
  2. 4°C에서 10분간 10,000 x g으로 균질 현탁액을 원심 분리합니다.
  3. 4°C에서 1시간 100,000 x g으로 상층액을 초원심 분리합니다.
  4. 마이크로솜 팰릿을 1% Tween 20이 포함된 가용화 완충액에 다시 띄웁니다.
  5. 4°C에서 1시간 동안 저어 용해시킵니다.
  6. 4°C에서 1시간 100,000 x g으로 초원심 분리합니다.
  7. 30K MWCO 멤브레인을 사용하는 Pall Ultrasette를 사용하여 4°C에서 상층액을 농축합니다. 300mL를 10mL로 농축한 후 DE-53 칼럼 완충액을 사용하여 100mL로 희석합니다.
  8. 시료를 DE-53 음이온 교환 칼럼에 로드하고 세척한 후 효소를 pH 기울기로 용리합니다.
  9. Minimate 캡슐 또는 30K MWCO 멤브레인이 든 회분식 셀 장치로 용리액을 농축합니다. 350mL를 6mL로 농축한 후 3mL 완충액으로 멤브레인을 세척합니다.
  10. 농축액을 Sephadex G-200 크기의 칼럼에 올려 최종 과정을 시작합니다.

일람표 1

Cyclooxygenase-2를 사용한 비교 테스트

독립적 정제 회분식 셀 1 회분식 셀 2 회분식 셀 3 Minimate 1 Minimate 2 Minimate 3
초기 단백질 농축액(mg/mL) 15.0 14.5 15.0 13.6 14.1 14.7
초기 특정 활동(U/mg) 66.7 62.1 70.9 73.5 67.4 74.8
농축 인자 50 46 50 40 44 41
최종 특정 활동 220 196 191 200 217 206
최종 수율(SA/mg 총 단백질) 0.048 0.045 0.043 0.042 0.044 0.040
처리 시간(시간) 8.0 8.0 8.0 2.5 2.5 2.5

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결론

작동이 간편한 Minimate TFF 시스템은 최대 1리터의 단백질 시료 농축 또는 버퍼 교환용으로 가장 빠르고 믿을 수 있는 선택입니다. 일체형 TFF 캡슐은 세척하여 재사용할 수 있으므로 설치 및 작동 시간이 절감됩니다(5). 반면 회분식 셀 시스템은 조립이 필요하며 작동 시간이 길고 집중적인 모니터링이 필요하며 최대 1리터의 시료량을 처리하려면 여러 차례에 걸쳐 보충해 주어야 합니다. 이 문서에서는 Minimate 캡슐이 비교 대상인 회분식 셀 시스템에 비해 5배나 빨리 단백질 1리터를 농축할 수 있었음을 밝혔습니다. 이러한 발견은 Cyclooxygenase-2 효소 정제를 독립적으로 연구한 연구원이 단백질 활동 손실 없이 처리 시간이 3배 줄어든 결과를 얻으면서 재차 확인되었습니다.

Minimate TFF 캡슐은 소량(1리터 이하) 처리의 경우에는 효과적이지만 양이 많을 때는 여러 개의 Minimate TFF 캡슐을 병렬로 구성하는 다중화 방식으로 처리할 수 있습니다. 또한 Minimate TFF 캡슐은 더 큰 TFF 장치와 같은 유동 경로 길이로 설계되어 있어 파일럿 플랜트 및 생산 플랜트에서 연구소 규모 이상으로 확장해도 귀중한 최적화 시간을 절감할 수 있습니다.

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참고문헌

  1. L. Schwartz and K. Seeley, 2002. Introduction to Tangential Flow Filtration for Laboratory and Process Development Applications. Pall Scientific & Technical Report, PN 33213.
  2. L. Schwartz, 2003. Diafiltration: A Fast, Efficient Method for Desalting or Buffer Exchange of Biological Samples. Pall Scientific & Technical Report, PN 33289.
  3. L. Schwartz, 2003. Desalting and Buffer Exchange by Dialysis, Gel Filtration or Diafiltration. Pall Scientific & Technical Report, PN 33290.
  4. J. Jenco, T. Hu, L. Schwartz, and K. Seeley, The partnership of the Minimate TFF Capsule with Liquid Chromatography Systems Facilitates Lab-Scale Purifications and Process Development Through In-Line Monitoring Technical Report.
  5. Minimate 취급 및 사용 설명서(전자 형식, Minimate TFF 제품 패키지에 CD 형태로 포함).